Optimalisatie van mutatietechnieken in Cupriavidus metallidurans

In dit project werd er gezocht naar een verbeterde techniek om knockouts te maken in Cupriavidus metallidurans. C. metallidurans is een bacterie die zeer goed bestand is tegen verschillende metalen en antibiotica. Dit onderzoek is nodig omdat de methode die men nu gebruikt steeds een antibioticumresistentiemerker achterblijft in het chromosomaal DNA van de bacterie. Als men dan meerdere knockout genen wil verkrijgen in 1 bacterie dan moet er elke keer gezocht worden naar een ander antibioticum. En aangezien C. metallidurans al van nature al zeer resistent is tegen een aantal antibioticums zou het handig zijn indien deze antibioticumresistentiemerkers er ,nadat een knockout gemaakt is, er ook weer uit gehaald kunnen worden. In dit onderzoek werd de effectiviteit van de selectie met het sacB-gen getest en werd er getest bij welke sucrose concentratie dit het beste resultaat gaf. Dit bleek bij een concentratie van 10% te zijn. Omdat de gemaakte FRT-kanamycineresistentie-FRT cassette gelegen was tussen twee fragmenten die ook rond het test gen zitten kon er homologe recombinatie gebeuren (de gemaakte cassette kwam in de plaats van het test gen). Het gen dat via correcte dubbele homologe recombinatie in het chromosomaal DNA van NA4 gebracht werd ingesloten door een FRT (Flipase Recognition Target) site. Deze FRT-kanamycineresistentie cassette werd dan gebruikt om van een test gen een knockout te maken. Het maken van de knockout voor dit test gen is gelukt in dit onderzoek maar de excisie van het antiobioticumresistentiegen door FLP-FRT recombinatie gebeurd in een vervolg onderzoek. Als extra electie methode bij deze knockout techniek werd er ook onderzoek gedaan naar het gebruik van een pan_gfp cassette die dan geplaatst wordt in het deel van het plasmide dat niet ingebouwd wordt in het genomisch DNA van de bacterie. De kolonies met deze cassette (de fouten recombinanten) zouden dan fluorescentie moeten geven. Er werd ook een experiment gedaan met pop in/ pop out genen waarbij er enkele basenparen tussen de omringende regio’s van het test gen geplaatst werden. Eerst wordt via homologe recombinatie het hele plasmide ingebouwd worden (pop-in). Waarna er een pop-out gebeurt door middel van het sacB gen. Waarna een merkerloze knockout overblijft. In een vervolg experiment wordt getest of deze techniek ook zorgt voor een knockout van het test gen.